¿Cómo encontrar un método de extracción de ARN que funcione para tu laboratorio?
August 23, 2021
Desde el inicio de la pandemia de COVID-19 en 2020, ha sido de suma importancia para los investigadores y científicos poder hacer diagnósticos de COVID-19 con precisión. Dichos diagnósticos son esenciales no solo para determinar qué individuos están en riesgo, sino también para agregar al grupo de investigación colectiva a nivel mundial sobre la pandemia que ha ido en constante crecimiento desde 2020.
Si bien hay muchas formas de realizar un diagnóstico de COVID-19, tres elementos que tienen una gran demanda son: Medios de transporte viral (tubos que contienen una solución de estabilización de ARN que permite preservarlo y en muchos casos incluso inactiva el virus haciendo más segura la manipulación de las muestras para el personal), Kits de extracción de ARN viral (que aíslan el ARN viral de hisopos o saliva) y master mixes para RT-qPCR (que ayudan a identificar si hay o no SARS-COV-2 en la muestra mediante de la amplificación o no del material genético del virus).
Más allá de la demanda de productos, pasemos al proceso real para llegar a un diagnóstico de COVID-19: El primer paso es la recolección de la muestra. Esto se hace comúnmente con un hisopo nasal u oral o incluso con saliva (escupiendo dentro de un recipiente destinado para ello). El segundo paso, que es en el cual que nos centraremos en el presente artículo, es el de la extracción de ARN, que se puede realizar con varios métodos diferentes.
Extracción de ARN mediante columnas giratorias (spin columns) de sílice
De acuerdo a kbDNA, la extracción de ARN basada en columnas es una de las mejores técnicas entre las opciones disponibles y desempeña un papel vital en los métodos de intercambio iónico ya que proporciona una fase estacionaria robusta para un intercambio de buffer rápido y confiable y, por lo tanto, la extracción de ácidos nucleicos. Este método es rápido y reproducible y requiere de una centrífuga para su realización. Los sistemas basados en vacío también se pueden utilizar en lugar de la centrifugación para separar las impurezas. Los investigadores también pueden combinar el método de extracción orgánica con el método de columna giratoria para obtener un rendimiento de ARN mayor y más rápido. Este método es rápido (20 minutos) y apto para el procesamiento a gran escala y de alto rendimiento, incluidos los métodos automatizados. La contaminación por proteínas o ADN es posible si la cantidad de muestra es grande o permanece homogeneizada o lisada de manera incompleta. La lisis incompleta también puede conducir a bajos rendimientos de ARN viral. La automatización puede ser compleja y costosa debido a la necesidad de configurar sistemas de centrifugación o separación por vacío. (Viral RNA Isolation Methods Reviewed: Spin vs. Magnetic (kbdna.com).
Además de que la extracción de ARN basada en columnas es una de las mejores técnicas disponibles, el Kit de extracción de ARN viral de IBI Scientific, en particular, puede adaptarse a plataformas automatizadas, lo que lo hace muy versátil.
Figura 1. Esquema simplificado del aislamiento de ARN mediante tecnología de columnas giratorias. El elemento aglutinante en los sistemas de columna giratoria suele estar compuesto por partículas de vidrio o polvo, matrices de sílice, tierra de diatomeas e intercambiadores iónicos. En este método la unión de ácidos nucleicos se optimiza con buffers específicos y concentraciones de sales y pH extremadamente precisas. Los lisados de muestra se pasan a través de la membrana de sílice usando fuerza centrífuga, lo cual resulta en la unión del ARN al gel de sílice al pH apropiado. A continuación, se lava la membrana que contiene proteínas residuales y sal para eliminar las impurezas y se descarta el flujo. Posteriormente el ARN se eluye con agua libre de RNAsas. (Tomado de Viral RNA Isolation Methods Reviewed: Spin vs. Magnetic (kbdna.com).
Extracción de ARN viral mediante perlas magnéticas
De acuerdo a kbDNA, el método basado en perlas magnéticas se fundamenta en el uso de perlas magnéticas y reactivos optimizados para la extracción de ARN. Las perlas tienen un núcleo paramagnético, generalmente recubierto con sílice, para la unión del ácido nucleico. La muestra se lisa en un buffer con inhibidores de RNAsas y luego se incuba con las perlas magnéticas, lo que permite que las partículas se unan a las moléculas de ARN. Las perlas magnéticas se pueden recoger rápidamente colocándolas cerca de un campo magnético externo. Se elimina el sobrenadante y las perlas se lavan posteriormente con un buffer de lavado adecuado con eliminación del campo magnético. Este proceso se puede repetir fácilmente para múltiples lavados. El ARN se eluye de las perlas magnéticas con agua libre de RNAsas y luego se puede transferir el sobrenadante (que contiene el ARN puro). (Viral RNA Isolation Methods Reviewed: Spin vs. Magnetic (kbdna.com).
Figura 2. Esquema simplificado del aislamiento de ARN mediante tecnología de perlas magnéticas. Los lisados de muestras se incuban con perlas magnéticas generalmente recubierto con sílicepara la unión de los ácidos nucleicos. Dicha mezcla se expone a un magneto que retiene las perlas con los ácidos nucleicos y permite eliminar el resto de la muestra y mediante subsecuentes pasos de lavado con buffers adecuados y finalmente con agua libre de RNAsas eluir el ARN de interés. (Tomado de Viral RNA Isolation Methods Reviewed: Spin vs. Magnetic (kbdna.com).
Más allá de la ciencia de cada método en particular, existen algunas diferencias notables entre estos métodos de extracción
Para empezar, mientras que el método basado en perlas magnéticas requiere un soporte magnético, el método basado en columnas requiere una centrífuga o en sistema de vació. Además, si bien no hay preocupación por la obstrucción con el método basado en perlas magnéticas (debido a lo pequeñas que son las perlas magnéticas), existe una posible preocupación de obstrucción con el método basado en columnas. En tercer lugar, mientras que el método basado en columnas tiene un alto nivel de pureza, el basado en perlas magnéticas en realidad tiene el nivel más alto de pureza. Sin embargo, una ventaja de los kits basados en columnas respecto a los de perlas magnéticas, es que los segundos muchas veces incluyen ARN carrier para ayudar a la aglutinación del ARN en torno a las muestras y este ARN puede interferir en aplicaciones posteriores como secuenciación, cosa que no ocurre con los kits basados en columnas giratorias, ya que estos por lo general no requieren ARN carrier.
Haciendo a un lado las diferencias entre ambos métodos, tanto el basado en columnas como el de perlas magnéticas no contienen residuos peligrosos de solventes orgánicos, son adecuados si se requieren analizar grandes cantidades de muestras en poco tiempo y lo más importante es que ambos métodos ayudan en el diagnóstico de COVID-19, que es de suma importancia en el estado pandémico en el que aún vivimos.
Ahora que estás familiarizado con estos dos métodos es posible que te preguntes ¿Cual método es más adecuado para mí y para mi laboratorio?
Comenzando con los kits "basados en columnas", estos son ideales para laboratorios que están estudiando infecciones por virus. Tomemos, por ejemplo, el SARS-COV 2 actualmente relevante que se descubrió en murciélagos en China, y que, como todos saben, finalmente se abrió camino en los humanos. Los kits basados en columnas son los más adecuados para laboratorios que no procesan miles de muestras por semana. Por otra parte, la extracción basada en perlas magnéticas, y más específicamente con el kit ViraMag de IBI Scientific, se realiza casi exclusivamente a través de un sistema robótico, lo que automatiza todo el proceso. Estos sistemas robóticos pueden ejecutar miles de pruebas por día, mucho más de lo que una persona podría hacer manualmente. Por lo tanto, en términos de decidir el método ideal para tu laboratorio, realmente depende de cómo funciona el laboratorio e cuestión y de los sistemas que se utilizan en él todos los días. Si tu laboratorio está más automatizado y ya tiene un sistema robótico, podría tener más sentido elegir un kit de extracción por perlas magnéticas. Por otro lado, si su laboratorio no utiliza un sistema automatizado, podría ser mejor elegir un método basado en columnas.
Al final del día, ambos métodos de extracción de ARN funcionan perfectamente bien para ayudar en el proceso de producir un diagnóstico de COVID-19. En el contexto actual en el que estamos, todavía viviendo en un estado pandémico cada vez más apremiante, es de vital importancia que tales métodos de extracción permanezcan fácilmente disponibles para los investigadores, que todavía están trabajando día y noche para detener el COVID-19 en su avance y proporcionar información valiosa en el proceso.
En AllScience nos preocupamos mucho por las diversas necesidades y dificultades potenciales de nuestros clientes y la comunidad científica en general. También apoyamos a un número cada vez mayor de centros de investigación que trabajan diligentemente para combatir el COVID-19 a través de la extracción de ARN junto con cualquier otra infección viral potencial. Puedes encontrar diversos productos para todas las etapas del proceso de detección del SARS-COV-2 en nuestra sección dedicada al COVID-19, incluyendo kits para extracción de ARN viral que tenemos disponibles para entrega inmediata. No dudes en consultarnos, nuestros representantes se encargaran de conseguir la mejor solución posible para que logres con éxito tus objetivos.
