Técnicas de inmunohistoquímica de última generación
October 16, 2020
Anticuerpos monoclonales conjugados analizados mediante espectroscopia de masas permiten multiplexing cuantitativo en muestras de tejido intactas.
Los últimos avances en las técnicas de Inmunohistoquímica (IHQ) han permitido incrementar en varios órdenes de magnitud su rango dinámico. Este salto significativo en la cantidad de proteínas que pueden detectarse en una muestra de tejido se considera ya la próxima generación de IHQ.
El rango dinámico de IHQ es 1 log y 2.5 logs en el caso de inmunofluorescencia cuantitativa (QIF), que mide la cantidad relativa de una proteína concreta en una muestra de tejido (Rimm, 2014). Mediante IHQ y espectroscopia de masas combinadas (MSIHC) se alcanzan valores de hasta 5 logs.
Actualmente, las técnicas de IHQ presentan limitaciones debido a la restricción en las técnicas de detección, la pérdida de resolución espacial con métodos cromogénicos, perdida de sensibilidad con métodos fluorescentes, heterogeneidad y variabilidad en el pre procesado de muestras.
La posibilidad de llevar a cabo técnicas de visualización de tejidos de forma multiplex y directamente cuantificadas permite superar muchas de estas limitaciones en IHQ. Se trata de tecnología punta en investigación básica y clínica.
Espectroscopia de masas y análisis inmunohistoquímico combinados: laser frente a haz de iones.
La citometría de masas permite medir múltiples genes en la misma célula para definir su función. Anticuerpos primarios contra una proteína concreta se conjugan con metales raros de lantánidos que tienen una masa determinada fácilmente distinguible por el citómetro de masas. Estos anticuerpos se incuban con las muestras de tejido de forma similar a un protocolo estándar de IHQ.
Un aspecto clave en este proceso es la necesidad de liberar los iones de los metales pesados para separarlos y cuantificarlos con el mínimo solapamiento posible. La cantidad de metales pesados detectados es proporcional a la cantidad de proteína unida a los anticuerpos conjugados. El instrumento permite analizar >1000 células/s, y puede aplicarse a un experimento habitual de inmunotinción.
Dos grupos de investigación han combinado estas técnicas de forma ligeramente diferente.
El grupo de Bernd Bodenmiller usa un instrumento comercial CyTOF (citómetro de flujo modificado para permitir detectar anticuerpos conjugados y evaluados por espectroscopia de masas “time-of-flight” (TOFMS)) que utiliza un laser para destruir el tejido /anticuerpos e iones libres de metales pesados a una resolución de 1uM.
Se genera así una imagen bidimensional muy similar a la imagen de una IHQ de rutina, pero conteniendo información multiplex cuantitativa (Giesen et al., 2014).
El grupo de Garry Nolan usa un barrido de un haz de iones para liberar los iones, lo que conlleva una mayor resolución (menor cantidad de iones vaporizados por unidad de tiempo permite una mayor claridad celular), pero requiere una configuración más especializada (vacío, detector múltiple de masas). Este método se llama “multiplexed ion beam imaging (MIBI)” (Angelo et al., 2014).
Ambos grupos usan un software especializado para reconstruir las imágenes 2D del tejido teñido por los iones de metales pesados detectados.
Ventajas
La gran ventaja de esta técnica es que se pueden analizar múltiples anticuerpos monoclonales contra una misma proteína, permitiendo determinar la especificidad de un anticuerpo comparándolo directamente con otros. Gracias a ello se pueden analizar las diferentes especificidades de los anticuerpos hacia dominios distintos de la proteína en función de los cambios en la estructura proteica o de las modificaciones postraduccionales.
Esta técnica también tiene la ventaja de permitir estudiar pequeños cambios en múltiples proteínas a la vez, debido al uso simultáneo de un mayor número de iones de metales pesados (alta capacidad de “plexing”). Finalmente, la ventaja del multiplex permite el uso de anticuerpos contra proteínas housekeeping como referencia y normalización, proporcionando información pre procesada detallada y resultados de IHQ más reproducibles y precisos. Se abre así una puerta de una IHQ más fiable para aplicaciones clínicas y diagnosticas.
Se necesitan anticuerpos validados en IHQ de alta calidad.
Es importante destacar que para poder llevar a cabo ambos métodos la calidad de los anticuerpos es crucial. Anticuerpos sin una caracterización completa, o que presenten reactividad cruzada proporcionarán resultados no reproducibles debido a que la interacción entre el antígeno y el anticuerpo es básica para medir la expresión de la proteína.
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Rimm D (2014). Next-gen immunohistochemistry. Nat. Methods 11, 381–383
Giesen C, Wang HAO, Schapiro D, Zivanovic N, Jacobs A, Hattendorf B, Schuffler PJ, Grolimund D, Buhmann JM, Brandt S, Varga Z, Wild PJ, Gunther D, Bodenmiller B (2014). Highly multiplexed imaging of tumor tissues with subcellular resolution by mass cytometry. Nat. Methods 11, 417–422
Angelo M, Bendall SC, Finck R, Hale MB, Hitzman C, Borowsky AD, Levenson RM, Lowe JB, Liu SD, Zhao S, Natkunam Y, Nolan GP (2014). Multiplexed ion beam imaging of human breast tumors. Nature Med. 20, 436–442
