CRISPR-Cas 9: ¿Qué es? ¿Cómo funciona? ¿Qué aplicaciones tiene? y ¿por qué es una técnica tan revolucionaria y controversial a la vez?
November 06, 2019
En la película Gattaca, del ya lejano año 1997, se ilustraba una sociedad futura en la cual la mayor parte de los niños eran concebidos in vitro y con técnicas de selección genética que permitían a los padres “diseñar” su progenie de manera que estos contaran con todas las características deseables de ambos progenitores y sin ninguna que pudiera ser perjudicial, incluyendo enfermedades con componentes hereditarios como el asma. ¿Qué tan cerca estamos hoy en día de esa realidad? En el siguiente artículo lo vamos a descubrir.
El acrónimo CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats), que puede traducirse como “Repeticiones Palindrómicas Cortas Agrupadas y Regularmente Interespaciadas” hace referencia una serie de secuencias de ADN que precisamente cuentan con esas características; se “leen” igual en sentido 5’-3’ y en sentido 3’-5’ (Figura 1) y están repetidas y separadas en forma regular a lo largo del genoma de muchas bacterias, en las cuales constituyen una mecanismo de defensa ante infecciones víricas, conjuntamente con una serie de proteínas con actividad endonucleasa conocidas como Cas (CRISPR-associated), de las cuales la primera en ser utilizada en aplicaciones biotecnológicas fue la Cas 9, aunque en la actualidad se han descrito otras, por lo cual muchas veces se hace referencia a este mecanismo como CRISPR-Cas o simplemente sistema CRISPR. De manera concreta, en la naturaleza los sistemas CRISPR-Cas son sistemas de respuesta inmune adaptativa procariota que se encuentran en una amplia proporción de las especies bacterianas y en casi todas las especies de arqueas que se han secuenciado hasta la fecha.
Figura 1. Ejemplo de una secuencia palindrómica de ADN.
La maquinaria molecular involucrada en la inmunidad adquirida por el mecanismo CRISPR-Cas está codificada por el locus CRISPR como dos conjuntos de componentes genéticos que a menudo se encuentran uno al lado del otro en los genomas microbianos: El primero, un operón de múltiples genes Cas que codifica los componentes de dichas proteínas y el segundo, una matriz CRISPR de repeticiones cortas idénticas intercaladas con espaciadores de ADN invasor que codifican los componentes de los crRNA (ARN CRISPR no codificantes). Utilizando estos elementos los sistemas CRISPR-Cas median la inmunidad adaptativa (inmunización y defensa) a través de tres fases generales: Adaptación, procesamiento de crRNA e interferencia. Primero, durante la fase de adaptación, un subconjunto de proteínas Cas llamado “módulo de adaptación” obtiene e inserta fragmentos de un virus invasor u otro material genético extraño como una secuencia “espaciadora” en el comienzo de la matriz CRISPR en el genoma del huésped junto con una repetición CRISPR recién duplicada. La secuencia en el virus o plásmido que coincide con el espaciador adquirido se llama protoespaciador o PAM (Protospacer adjacent motif). Los espaciadores representan un historial de infecciones antiguas que ayuda a proteger al microorganismo en caso de que estas amenazas reaparezcan. En segundo lugar, la matriz CRISPR se transcribe y procesa en crRNAs individuales, cada uno con un fragmento de ARN correspondiente al virus o plásmido encontrado previamente junto con una parte de la repetición CRISPR. En tercer lugar, durante la fase de interferencia, los crRNAs guían el "módulo de interferencia", codificado por un complejo (el operón Cas) que puede comprender varias subunidades efectoras Cas o una proteína efectora única, para destruir al invasor mediante el clivaje de sus secuencias complementarias con los crRNAs, es decir, mediante la unión de los crRNAs a los PAMs (Figura 2).
Figura 2. Los sistemas inmunes adaptativos CRISPR-Cas ayudan a los microbios a defenderse de los fagos y otros materiales genéticos extraños. Durante la fase de inmunización (arriba), un módulo de adaptación inserta un nuevo espaciador, una secuencia de ADN derivado del genoma del invasor, en la matriz CRISPR. Durante la fase de defensa (abajo), los espaciadores se convierten en ARN guía que dirigen un módulo de interferencia a secuencias diana coincidentes (PAM), que luego son clivadas.
En base a sus proteínas efectoras únicas, los sistemas CRISPR-Cas se clasifican actualmente en seis tipos (I a VI), que a su vez se agrupan en dos clases amplias: Los sistemas de clase 1 (tipos I, III y IV) utilizan un complejo de proteínas para lograr la interferencia, y los sistemas de clase 2 (tipos II, V y VI) utilizan como efector para la interferencia una sola nucleasa, como la Cas9, Cas12 o Cas13. La modificación de este sistema inmune bacteriano ha llevado al desarrollo de una revolucionaria herramienta de edición del genoma conocida también como sistema CRISPR; principalmente la modificación del sistema CRISPR-Cas tipo II, que es la base de las aplicaciones actuales de ingeniería genómica. Puntualmente, el sistema CRISPR-Cas9 tipo II utiliza ARNs no codificantes para guiar la nucleasa Cas9 para inducir la escisión de ADN sitio-específica. Este daño del ADN se repara mediante mecanismos de reparación del ADN celular, ya sea a través de la vía de reparación del ADN de unión de extremo no homólogo (NHEJ, del inglés non-homologous end joining DNA repair pathway) o la vía de reparación dirigida por homología (HDR, del inglés homology-directed repair pathway) (Figura 3).
Figura 3. La enzima Cas 9 (azul) genera rupturas en el ADN bicatenario al usar sus dos centros catalíticos (representados como cuchillas) para escindir cada cadena de un sitio específico del ADN diana (amarillo) junto a una secuencia PAM (roja) y hacer coincidir la secuencia de 20 nucleótidos (naranja) del ARN guía (sgRNA). El sgRNA incluye una secuencia de ARN dual derivada del ARN CRISPR (verde claro) y un transcripto separado (tracrRNA, verde oscuro) que se une y estabiliza la proteína Cas9. La escisión de ADN mediada por Cas9-sgRNA produce una ruptura roma de doble cadena que desencadena enzimas de reparación para interrumpir o reemplazar secuencias de ADN en o cerca del sitio de escisión.
El sistema CRISPR-Cas 9 se ha aprovechado para crear un método simple programable por ARN que permite mediar la edición del genoma en células de mamíferos y se puede utilizar para generar inactivaciones de genes (mediante inserción / eliminación) o knockins (mediante HDR). Para crear disrupciones genéticas (Figura 4), se genera un ARN guía único (sgRNA) para dirigir la nucleasa Cas9 a una ubicación específica en el genoma que se desea modificar. Las rupturas de doble cadena inducidas por Cas9 se reparan mediante la vía de reparación de ADN NHEJ, que es propensa a errores y por lo tanto se pueden introducir inserciones y deleciones (INDEL) que pueden alterar la función del gen. Si bien la vía NHEJ da como resultado indeles aleatorios e interrupción de genes en el sitio objetivo, la vía HDR se puede aprovechar para insertar una plantilla de ADN específica (monocatenaria o bicatenaria) en el sitio objetivo para la edición precisa de genes.
Figura 4.Disrupción génica mediada por CRISPR-Cas 9. Un ARN guía (sgRNA), que consiste en una secuencia de crRNA que es específica para el ADN diana y una secuencia de tracrRNA que interactúa con la proteína Cas9 (1), se une a una forma recombinante de la proteína Cas9 que tiene actividad de endonucleasa de ADN (2). El complejo resultante provocará la escisión de ADN bicatenario específico del objetivo (3). El sitio de escisión será reparado por la vía de reparación del ADN de unión final no homogénea (NHEJ), un proceso propenso a errores que puede provocar inserciones / deleciones (INDEL) que pueden alterar la función del gen (4).
Antes de pasar a hablar sobre las aplicaciones, los avances que se han logrado empleando este sistema y las perspectivas futuras, es conveniente comentar sobre la historia del mismo y resaltar los hitos importantes que llevaron a su desarrollo como una poderosa herramienta biotecnológica (Figura 6). En investigaciones paralelas, pero completamente separadas, unos pocos laboratorios de microbiología y bioinformática a mediados de la década de los 2000 comenzaron a investigar las secuencias CRISPR, que habían sido descritas en 1987 por investigadores japoneses en el genoma de Escherichia coli. Posteriormente, se detectaron secuencias CRISPR en numerosas bacterias y arqueas y se hicieron predicciones sobre su posible participación en la reparación del ADN o la regulación génica. Un descubrimiento importante llegó en 2005 con la observación de que muchas secuencias espaciadoras dentro de los CRISPR derivaban de orígenes plasmídicos y virales. Junto con el hallazgo de que los loci CRISPR se transcriben y la observación de que los genes Cas codifican proteínas con dominios de nucleasa y helicasa putativos, se propuso que CRISPR-Cas era un sistema de defensa adaptativo que podría usar ARN antisentido como historial de memoria de invasiones pasadas. En 2007, experimentos de infección de la bacteria del ácido láctico Streptococcus thermophilus con fagos líticos proporcionaron la primera evidencia experimental de inmunidad adaptativa mediada por CRISPR-Cas. Este hallazgo condujo a la idea de que los sistemas naturales CRISPR-Cas existentes en bacterias cultivadas utilizadas en la industria láctea podrían aprovecharse para la inmunización contra los fagos, siendo esta la primera aplicación exitosa de CRISPR-Cas para fines biotecnológicos. En 2008, se demostró que los crRNA servían como guías en un complejo con proteínas Cas para interferir con la proliferación de virus en E. coli. Ese mismo año, se informó sobre la actividad dirigida al ADN del sistema CRISPR-Cas en el patógeno Staphylococcus epidermidis. En vista de la simplicidad relativa del sistema CRISPR-Cas9 Tipo II, los investigadores primero explotaron el uso de CRISPR para la edición de genes usando el sistema Cas9 de S. pyogenes. Fue así como en el año 2012, un equipo de investigadores dirigido por las doctoras Jennifer Doudna en la Universidad de California en Berkeley y Emmanuelle Charpentier en la Universidad de Umeå publicaron el primer uso de CRISPR-Cas9 para introducir rupturas bicatenarias en ADN objetivo específico y además demostraron que las unidades de crRNAs efectoras, que en la naturaleza son complejos de doble cadena, podían ser modificadas para convertirlas en ARN de cadena sencilla y que a pesar de esta modificación podían continuar dirigiendo el clivaje efectivo del ADN objetivo. Esto simplificó aún más CRISPR-Cas9 en un sistema de dos componentes: Una proteína Cas9 y un ARN guía único (sgRNA). Esta simplicidad hace que el sistema CRISPR Cas9 sea la herramienta más conveniente, simple y flexible para la edición de genes sitio-dirigida disponible actualmente. Un trabajo revolucionario paralelo al del grupo liderado por las doctoras Doudna y Charpentier fue reportado en el año 2013 por el doctor Feng Zhang del Broad Institute del Instituto Tecnológico de Massachusetts (MIT) (Figura 5). A partir de estos trabajos pioneros, el sistema CRISPR-Cas9 se ha implementado para la edición de genes en miles de laboratorios en todo el mundo. Las patentes CRISPR han sido otorgadas recientemente a Zhang en febrero de 2017 por la oficina de patentes de EE. UU. En marzo de 2017, la oficina europea de patentes hizo una declaración de concesión de una patente amplia a la Universidad de California, la Universidad de Viena y a Emmanuelle Charpentier.
Figura 5. Jennifer Doudna, Emmanuelle Charpentier y Feng Zhang. Sus trabajos pioneros en la aplicación del sistema CRISPR-Cas9 han servido de base en estudios posteriores y les valieron el otorgamiento de patentes relacionadas a este sistema de edición genética.
A lo largo de los años, las técnicas innovadoras de ingeniería del genoma como las Nucleasas Zinc Finger (ZFN o Zinc Finger Nucleases), las Endonucleasas Guiadas por ARN (RGENs o RNA Guided Endonucleases), el Activador Transcripcional Similar a Nucleasas Efectoras (TALEN o Transcriptional Activator like Effector Nucleases) y el sistema CRISPR-Cas han transformado por completo la edición del genoma en diferentes organismos; sin embargo, la efectividad de las ZFN y los TALEN se vio obstaculizada principalmente por el diseño, la síntesis y la validación de proteínas para un locus particular de ADN en estudio, siendo esta barrera superara con los sistemas CRISPR-Cas. La historia del desarrollo de los sistemas CRISPR involucra dos aspectos relacionados: Investigación biológica básica para comprender mejor el funcionamiento de estos elegantes sistemas de defensa y la aplicación de los mismos en potentes tecnologías moleculares. A medida que se expande el impacto de estas tecnologías se estimula el trabajo en la biología, que continúa brindando oportunidades tecnológicas adicionales. Por lo tanto, la primera parte de la revolución CRISPR involucró la ingeniería de Cas9 como tecnología de edición del genoma, pero a través del reciente descubrimiento y desarrollo de efectores de Cas adicionales, particularmente la familia Cas13 que se dirige al ácido ribonucleico (ARN), ha continuado expandiéndose a nuevas áreas. Las tecnologías basadas en CRISPR se están empleando de diversas maneras para mejorar la salud humana y ofrecen el potencial de cambiar fundamentalmente la forma en que tratamos las enfermedades.
Figura 6. Descubrimientos más importantes en las investigaciones del sistema CRISPR-Cas.
Desde la identificación del sistema CRISPR-Cas como una herramienta eficaz en la edición de genes, los investigadores han explorado su uso en la alteración del genoma de casi cualquier organismo con una facilidad y sofisticación incomparables. Su amplia gama de aplicaciones, junto con su velocidad y eficacia, le ha dado una ventaja sobre otras herramientas de edición de genes y ha revolucionado las aplicaciones biológicas en todo el mundo, incluyendo los siguientes usos:
Manipulación del genoma a través del sistema CRISPR-Cas9: Como herramienta de edición del genoma dinámica y multiplex, CRISPR-Cas9 permite la manipulación precisa de elementos genómicos específicos, lo que facilita a los investigadores dilucidar la función genes diana específicos en biología y enfermedades.
Investigación de línea germinal: CRISPR tiene ciertamente la aplicación más discutible en la investigación de la línea germinal humana, ya que cualquier alteración realizada en las células germinales es heredable, mientras que la edición de genes en las células somáticas no se transmitirá a las generaciones posteriores. La edición de la línea germinal puede ser potencialmente útil y, en algunos casos, la única opción viable para prevenir los efectos de una enfermedad genética devastadora en un futuro niño.
Generación de modelos experimentales para el estudio de enfermedades humanas: Uno de los logros más importantes ha sido el desarrollo de modelos animales usando CRISPR para ayudar a los investigadores a estudiar enfermedades. Dichos modelos se han hecho para cerdos, ratones, monos, ratas e incluso perros. Utilizando el sistema CRISPR-Cas9 se pueden generar, por ejemplo, ratones genéticamente modificados que tengan alelos marcados o reporteros, genes nulos, condicionales o mutados con precisión, utilizando un enfoque de un solo paso, para luego emplearlos en la investigación de la patología de enfermedades de interés y la función de determinados genes en el desarrollo. Con este enfoque ya se han generado modelos de ratón con mutaciones LKb1, KRAS y p53 para el adenocarcinoma de pulmón con sistemas distintivos CRISPR-Cas9 que utilizaron diversos reactivos como productos químicos, virus adenoasociados (AAV) y lentivirus para suministrar ARN guía (gRNA) en células inmunes y neuronas.
Edición genética en plantas: CRISPR-Cas9 también tiene aplicaciones notables en bilogía de plantas para producir fenotipos valiosos o generar resistencia a enfermedades. Varios estudios han reportado la aplicabilidad del sistema CRISPR Cas9 para la edición del genoma en plantas como Nicotiana benthamiana y Arabidopsis sp. y tres especies de cultivo (arroz, trigo y sorgo). En estos estudios, para lograr plantas con modificaciones hereditarias fue necesario generar líneas transgénicas que expresaran de forma estable Cas9 y el gRNA y recuperar la progenie con modificaciones específicas en generaciones posteriores. Sin embargo, la producción de transgénicos lleva mucho tiempo y por lo tanto, se necesitan métodos de entrega eficientes para acelerar y maximizar la utilidad de esta tecnología. Por otra parte, el sistema CRISPR-Cas9 pudiera potencialmente utilizarse en genómica funcional en plantas y biotecnología agrícola, a través de la edición de genomas mediada por virus. El virus cascabel del tabaco (TRV) introducido a través de Agrobacterium, es un vector eficiente para el silenciamiento génico inducido por virus en diversas especies de plantas. Su pequeño tamaño del genoma facilita la clonación, multiplexing, construcción de genotecas, las agroinfecciones y además tiene la ventaja de que el ARN viral no se integra en el genoma de la planta.
Otra aplicación destacable en este ámbito podría ser proporcionar inmunidad molecular contra virus de ADN. En este sentido, sgRNA dirigidos a las secuencias codificantes y no codificantes del virus del rizado amarillo de la hoja del tomate (TYLCV) han sido introducidos con éxito en plantas de Nicotiana benthamiana que mostraron una sobreexpresión estable de la endonucleasa Cas9. El sistema CRISPR identificó el virus de manera eficiente para la degradación introduciendo mutaciones en las secuencias objetivo.
Recientemente se han diseñado pepinos resistentes a los potyvirus (virus de la mancha de anillo de la papaya, virus de las venas amarillas del pepino y virus del mosaico amarillo, que causan una pérdidas de hasta 80% del rendimiento de los cultivos) utilizando CRISPR dirigido al gen eIF4E, que juega un papel central en la propagación de este tipo de virus. Otros ejemplos notables incluyen tomates resistentes a numerosas bacterias de los géneros Xanthomonas y Pseudomonas y trigo resistente al oídio (Figura 7). Monsanto está explorando la técnica para mejorar el rendimiento, la resistencia a las enfermedades y la tolerancia a la sequía en algunos cultivos. Por lo tanto, se puede decir que el sistema CRISPR-Cas9 está allanando el camino hacia un nuevo horizonte para el desarrollo de cultivos y la investigación básica en biología vegetal.
Manipulación genética de tejidos específicos: Utilizando el sistema CRISPR-Cas9, los investigadores pueden realizar una edición directa y eficiente del genoma de tejidos particulares como el cerebro y el hígado, empleando vectores AAV y / o inyección hidrodinámica. Así, por ejemplo, utilizando una inyección hidrodinámica directa en la vena de la cola (la vena más grande en la cola de los animales vertebrados) para administrar un plásmido que encapsula Cas9 y sgRNA al hígado, se ha generado un modelo de cáncer con mutaciones de Pten y p53. Además, recientemente, se ha descrito una aplicación eficiente y exitosa del sistema CRISPR Cas9 en sistemas nerviosos de mamíferos (específicamente ratones machos adultos) donde se realizó la inyección in vivo de una mezcla de plásmidos etiquetados con proteína verde fluorescente (AAV-spCas9 y AAV-spGuide) en la circunvolución dentada del hipocampo del animal.
Estudio de la función de genes particulares de interés: Para un biólogo molecular la elucidación del funcionamiento de los genomas y las células es un requisito previo para comprender enfermedades genéticas complejas. En este sentido, CRISPR ha permitido el estudio de las funciones epigenéticas que afectan la expresión génica y la identificación de las funciones de secuencias de ADN no codificantes. Para los estudios de genómica funcional en células el sistema CRISPR-Cas9 proporciona un enfoque altamente versátil y competente para crear genes inactivos que permiten determinar la función del gen en cuestión tanto en procesos biológicos como en enfermedades con alta resolución. Por ejemplo, esta tecnología se ha utilizado para producir la eliminación de genes CCR5 y C4BPB en células K562 de leucemia mieloide humana. Además, también se ha llevado a cabo la introducción de mutaciones puntuales específicas en pez cebra y ratón.
Generación de múltiples mutaciones genéticas de manera simultánea: La capacidad del sistema CRISPR-Cas9 para producir diversas mutaciones genéticas en múltiples organismos se ha evidenciado cada vez más. Uno de los principales logros ocurrió en 2013 con la introducción de mutaciones genéticas múltiples en embriones de ratas en etapa de una sola célula mediante la entrega simultánea de seis sgRNA que apuntaban a seis regiones genómicas que codifican la enzima Tet1 (sgTet1-1, sgTet1-2), Tet2 ( sgTet2-1, sgTet2-2), Tet3 (sgTet3-1, sgTet3-2), junto con mRNA Cas9 en el citoplasma celular. Por otra parte, en Arabidopsis, se pueden crear numerosos mutantes genéticos utilizando el sistema CRISPR-Cas9 para la generación de plantas T1 que expresen el gen del virus del mosaico del tabaco, mientras que para la generación de T1 sin mosaico, se requiere la expresión específica de Cas9 y sgRNA que se dirijan a los genes ETC2, CPC y TRY en células de huevo y en etapa unicelular en embriones de dichas plantas.
Corrección de mutaciones genéticas: Aunque el enfoque más directo para tratar una enfermedad genética humana implica corregir las mutaciones causales de la enfermedad mediante la terapia génica, recientemente se ha demostrado que esto también puede hacerse de manera rápida y eficiente mediante la edición del genoma con el sistema CRISPR-Cas9 en cultivos de células madre humanas.
Como terapia en enfermedades que afectan el sistema inmune: Otro uso impresionante del sistema CRISPR-Cas9 es que puede ser una estrategia terapéutica única contra el Virus de Inmunodeficiencia Humana (VIH), porque puede modificar secuencias codificantes o no codificantes en las etapas de preintegración o provirus, interrumpiendo así la expresión y replicación viral y finalmente causando la interrupción de la infección. Además, se ha sugerido el tratamiento de la infección por el virus de la hepatitis B (VHB) también mediante el uso del sistema CRISPR Cas9 provocando la inhibición de la replicación del VHB, lo que resulta en la baja regulación de la proteína del VHB y el ADN circular cerrado covalentemente (cccDNA). Esto se puede hacer inyectando a través de la vena de la cola plásmidos que tienen Cas9 y sgRNA dirigidos a las regiones conservadas del VHB.
Edición epigenómica: Además de la modificación directa de secuencias de ADN diana, el sistema CRISPR también abarca la alteración del epigenoma para la regulación de la expresión génica específica. Cabe recordar que el epigenoma comprende todos los compuestos químicos que se han agregado a la totalidad del ADN (genoma) como una forma de regular la actividad (expresión) de todos los genes dentro del genoma. Los compuestos químicos del epigenoma no son parte de la secuencia de ADN, sino que están adheridos a este. Las modificaciones epigenéticas permanecen a medida que las células se dividen y, en algunos casos, se pueden heredar de generación en generación. Las influencias ambientales como la dieta de una persona y la exposición a contaminantes también pueden afectar el epigenoma.
Inhibición de la metilación del ADN: El sistema CRISPR-Cas9 se ha empleado para suprimir la metilación del ADN en células humanas, lo cual finalmente causa la muerte celular. Esto se ha logrado al interrumpir el dominio catalítico de las metiltransferasas de ADN (DNMT).
Regulación de la expresión genética: Para la regulación de los procesos epigenéticos y la expresión génica, el sistema CRISPR-Cas9 se ha aplicado al ARN largo no codificante (lncRNA o long non-coding RNA), así como al ARN potenciador (eRNA o enhancer RNA). Por ejemplo, en la línea celular CH12F3, un subclón de la línea celular de linfoma lgM + CH12.LX, las deleciones inducidas por el sistema CRISPR-Cas9 causaron la regulación negativa tanto del elemento que expresa eRNA (lncRNA-CSR) como de los potenciadores que expresan lncRNA.
Regulación de la transcripción: La interferencia CRISPR o CRISPRi, una modificación del sistema CRISPR-Cas9, ha sido desarrollada recientemente para la regulación transcripcional dirigida por ARN. Para ello, fueron creadas proteínas Cas9 mutantes (dCAS9) y un complejo de reconocimiento que co-expresaba dCas9 con gRNA podía interferir la elongación transcripcional, la unión de la RNA-polimerasa y el factor de transcripción. Adicionalmente, utilizando la proteína de fusión al núcleo dCas9 p300 (formada por la fusión de cCas9 con el dominio del núcleo de histona acetiltransferasa catalítica de p300) la expresión génica puede regularse de manera factible alterando la acetilación en los promotores o potenciadores proximales y terminales (sitios objetivo).
Transgénesis de animales de granja (ganado) o de gran tamaño: La tecnología CRISPR-Cas se ha aprovechado en la transgénesis de animales grandes o tradicionalmente criados como ganado. Informes recientes han descrito los primeros experimentos exitosos utilizando sistemas CRISPR-Cas para inducir modificaciones genómicas en cerdos y vacas. Las variantes alélicas de interés agronómico se pueden introducir directamente en la raza deseada a través de donantes de oligonucleótidos y nucleasas específicas; por ejemplo, es posible eliminar genéticamente los cuernos en toros mediante la introducción de la variante alélica Angus POLLED.
Manipulación del ARN: Además de la manipulación de ADN bicatenario, la edición de secuencias de ARN también se puede lograr utilizando el sistema CRISPR-Cas9, con una proteína Cas9, un oligonucleótido de ADN presentador de PAM (PAMmer), el gRNA y ssRNA (ARN de cadena sencilla).
Terapia génica: Los estudios de terapia génica han sido revolucionados por la utilización del sistema CRISPR-Cas9 (sobre todo con las últimas nucleasas que se han diseñado) que se ha convertido en una herramienta de edición genómica innovadora y muy competente. Es así como se han reportado avances notables como una expresión de VIH-1 sustancialmente reducida en células humanas infectadas con el Virus de Inmunodeficiencia Humana (VIH) debido a la interrupción del promotor de repetición terminal larga en el genoma de VIH-1 utilizando CRISPR Cas9. El sistema también se puede utilizar para eliminar genes provirales que se han integrado en los genomas de la célula huésped. Las células madre pluripotentes inducidas (iPSCs) también son de considerable interés en la terapia génica y el modelado de enfermedades debido a su propiedad de autogeneración indefinida y diferenciación pluripotencial. Usando CRISPR-Cas9 se ha logrado generar un modelo celular iPS para el síndrome de anomalías faciales (ICF) causado por la mutación del gen DNMT3B, la inmunodeficiencia y la inestabilidad de la región centromérica. Las investigaciones que se están desarrollando actualmente tienen como objetivo tratar los trastornos genéticos oculares mediante la edición del ojo, siendo este un procedimiento técnicamente menos complicado que la edición del intrincado tejido cerebral.
CRISPR-Cas9 en la biología del cáncer: A pesar de los estudios amplios y vívidos sobre la biología molecular del cáncer humano en la última década, el entendimiento de las mutaciones responsables del inicio y progresión de los tumores cancerígenos aún no se ha logrado por completo. Dado que el sistema CRISPR-Cas9 puede dirigirse virtualmente a varias mutaciones a la vez, se puede emplear para modelar enfermedades genéticas complejas como el cáncer. Es así como se han creado métodos basados en CRISPR-Cas9 para “interrogar” rápidamente la función de genes supresores de tumores (como Pten y Apc) en modelos de cáncer de pulmón de ratón. Otro aporte importante del sistema CRISPR Cas en el estudio de la biología del cáncer es su capacidad para producir translocaciones cromosómicas asociadas al tumor (que normalmente ocurren durante la carcinogénesis a través de la unión ilícita no homóloga de dos cromosomas) mediante la introducción de roturas de doble cadena en posiciones bien definidas. Este enfoque ha sido explotado para la generación exitosa de células primarias y líneas celulares cancerígenas que tienen translocaciones cromosómicas y se replican de manera similar a las que se encuentran en tipos de cáncer como el cáncer de pulmón, el sarcoma de Ewing y la leucemia mieloide aguda.
Desarrollo de nuevos fármacos: Recientemente, muchas compañías nuevas como Intellia Therapeutics y Editas Therapeutics han colaborado con compañías farmacéuticas con la esperanza de aprovechar la tecnología CRISPR-Cas9 para el desarrollo de nuevos medicamentos para el tratamiento de enfermedades genéticas.
Figura 7. El Oídio, también conocido popularmente como ceniza, blanquilla o moho blanco, se trata de un hongo que forma parte de la familia de Erisifáceos (Erysiphaceae) y contiene un gran número de especies distintas (900 aprox.) que afectan a diversas especies de plantas y árboles alrededor del mundo.
A pesar de todas las bondades y aplicaciones descritas hasta ahora es importante indicar también las limitaciones que tiene actualmente esta tecnología. Estudios recientes han sugerido que la edición de genomas utilizando CRISPR es más susceptible a efectos off-target (mutaciones fuera de las secuencias diana u objetivo) que otras herramientas de edición genómica como TALENs o ZFNs. Junto con la transfección o transducción, la manipulación genómica usando CRISPR-Cas9 también depende de la selección, la confirmación de la variación inducida y la expansión clonal de las entidades modificadas. En este contexto debe observarse que hasta la fecha las modificaciones mediadas por CRISPR Cas9 de tipos de células primarias (principalmente células postmitóticas) se han documentado solo con vectores adenovirales en lugar de los vectores lentivirales generalmente utilizados en este tipo de ensayos. Por esta razón, si se compara con otras aproximaciones como la utilización de ARN de interferencia (RNAi), la tecnología CRISPR Cas9 requiere, metodológicamente, más tiempo y esfuerzo. Sin embargo, las tasas de mutación off-target de los distintos sistemas CRISPR-Cas9 continúan siendo un desafío aún más relevante. Por último, la edición directa y definida del genoma ha suscitado inquietudes éticas, como la creación de bebés modificados genéticamente mediante la alteración genética de las células de la línea germinal humana empleando el sistema CRISPR-Cas9, lo cual ha sido motivo de discusiones y debates entre los científicos y el público en general. Además, se han planteado graves preocupaciones con respecto al equilibrio ambiental y a la seguridad de las especies debido a la invención de la reacción mutagénica en cadena (MCR) basada en el sistema CRISPR-Cas9, la cual ha proporcionado una forma novedosa de generar mutaciones homocigóticas de pérdida de función por autocatálisis, como se ha confirmado en Drosophila; donde se ha demostrado que el fenotipo de la descendencia generada a partir de la hibridación de un individuo de tipo silvestre con un homocigoto que contiene el sistema CRISPR-Cas9, son todos homocigotos, de acuerdo con la herencia teórica basada en MCR. Adicionalmente, la mutagénesis off-target plantea dudas sobre el uso de la tecnología de edición del genoma CRISPR-Cas9, particularmente en el caso de la terapia génica, donde es imperativo prestar especial atención a las mutaciones fuera del objetivo antes de las aplicaciones clínicas debido al efecto de estos cambios genéticos no deseados en la salud de las personas objeto de estudio en un ensayo clínico.
En resumen, aún queda un largo camino por recorrer en todo lo relacionado a este revolucionario sistema de edición genómica, iniciando por estudios más amplios que lleven a una comprensión más profunda de los distintos elementos que lo componen. Por lo pronto, para ampliar la información suministrada en este artículo es recomendable consultar los reviews utilizados como base para la escritura del mismo en la sección referencias bibliográficas y los artículos, videoconferencias y otras herramientas que ofrece Takara Bio en su Learning center dedicado a este tema, además de todos los productos para aquellos investigadores que estén actualmente utilizando esta potente herramienta biotecnológica.
Noviembre 2019, Iván León.
Ivan Leon
Representante de Allscience
Referencias Bibliográficas
Shah, S.Z; Rehman, A; Nasir, H; Asif, A; Tufail, B; Usama, M; Jabbar, B. 2019. Advances in research on genome editing crispr-cas9 technology. J Ayub Med Coll Abbottabad 31:108–122
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Lohrasbi, V; Shirmohammadlou, N; Jahanshahi, A; Razavi, S. 2019. Overview development and applications of CRISPRCas systems after a decade of research with a glance at anti-CRISPR proteins. Rev. Med. Microbiol. 30:47–55.
