¿Cómo seleccionar y optimizar los anticuerpos primarios para la técnica de IHC?

November 08, 2018

La inmunohistoquímica (IHC) es una técnica ampliamente utilizada para analizar la anatomía del tejido de interés y para visualizar la expresión, la localización y la intensidad de un antígeno específico. Aunque la IHC es una técnica relativamente fácil y directa, la calidad de la tinción puede verse influida por variables que deben considerarse para producir datos confiables y consistentes. A continuación, te indicaremos los conceptos que debes tener en cuenta para seleccionar un anticuerpo primario y realizar la técnica IHC con éxito.

¿Qué es un anticuerpo primario?

Un anticuerpo primario es una inmunoglobulina que se une específicamente a una proteína particular u otra biomolécula de interés con el propósito de purificarla, detectarla y medirla. Se definen por sus parátopos de la región variable del anticuerpo que muestran una unión específica a los epítopos diana de una proteína. Esta unión específica trasciende a IHC, donde se pueden usar anticuerpos para detectar marcadores de antígenos específicos en muestras de tejido.

Esta fuerza de unión a menudo se puede cuantificar con la constante de afinidad (Ka). Los factores que determinan este valor dependen de qué tan bien encajen los epítopos diana en los parátopos del anticuerpo. Es de gran importancia tener en cuenta la afinidad de unión, ya que esta propiedad influye en las consideraciones para la dilución óptima del anticuerpo, el tiempo de incubación y la resistencia del ciclo de lavado consecutivo en la técnica IHC.

¿Cómo puedo validar la especificidad de unión de anticuerpos para mi objetivo de interés?

La información sobre la secuencia de la proteína objetivo y los estados posteriores a la traducción generalmente se pueden obtener de una base de datos de secuencias de proteínas como UniProt. Para muchos, el primer método de validación es comparar la homogeneidad entre el inmunógeno del anticuerpo y la secuencia de la proteína objetivo utilizando programas de alineación de secuencias como BLAST. En las situaciones óptimas, el uso de técnicas adicionales en conjunto puede proporcionar una validación aún mayor para la compatibilidad anticuerpo-antígeno.

Una problemática frecuente es la posibilidad de una unión no específica con otros antígenos endógenos que se pueden encontrar en la muestra. Esto a menudo proporciona una tinción de fondo indeseable que puede interferir con los resultados. Sin embargo, puede verificarse con el uso de un control negativo, que implica la tinción de muestras de tejido knockout que no expresen la proteína objetivo. Una alternativa más accesible sería obtener una línea celular establecida que no exprese la proteína diana. En cualquier situación, los resultados esperados deben mostrar una ausencia de señalización, lo cual debe ser comparado con el tejido en estudio.

Otro método para determinar si hay suficiente reactividad del anticuerpo primario contra el antígeno es la verificación con la técnica Western Blot. En el caso ideal, la reactividad se representa con la tinción de una única banda ubicada en el peso molecular de la proteína diana. Por el contrario, la presencia de bandas múltiples cerca del peso molecular deseado podría indicar modificaciones postraduccionales o reacciones no específicas.

¿Funcionará el anticuerpo en mi aplicación IHC?

En circunstancias ideales, se deberían emplear anticuerpos que hayan sido validados para IHC. Los anticuerpos que no se han validado, se prueban a menudo contra al menos otro método no inmunohistoquímico para que sirvan como fuentes de comparación para el éxito de la técnica. Sin embargo, se debe tomar en cuenta que un anticuerpo que funcione con éxito en un protocolo diferente no garantiza un buen desempeño en IHC. Un ejemplo frecuente es la transferencia Western. La tinción exitosa en muestras de Western Blot es una buena señal de que el anticuerpo también debería funcionar en IHC.

No obstante, las diferencias entre estos dos procedimientos también pueden evitar que el éxito se traduzca para la otra metodología. Por ejemplo, muchos protocolos de IHC introducen con frecuencia reactivos fijadores como el formaldehído y el glutaraldehído. Estos compuestos son capaces de producir puentes de entrecruzamiento con las proteínas, causando pequeñas variaciones en las estructuras terciarias de las proteínas, lo que podría provocar que la afinidad de unión del anticuerpo a su epitope diana disminuya. Este fenómeno, puede no observarse en la técnica de Wester Blot, donde se pueden utilizar lisados celulares u homogenatos, donde las proteínas se encuentren en su forma nativa. Sin embargo, la validación de estos métodos no inmunohsitoquímicos, sirven como herramientas invaluables para proporcionar información sobre el éxito experimental.

¿Qué tipo de anticuerpo debo usar? ¿Monoclonal o Policlonal?

Los anticuerpos monoclonales se derivan de líneas celulares de hibridoma, que es el resultado de que los linfomas de células B inmortalizados están expuestos a un antígeno de interés para provocar una respuesta inmune. Las especies animales hospedadoras comunes incluyen el conejo y el ratón. Los anticuerpos resultantes muestran una mayor especificidad hacia un epítopo de un antígeno en particular. Una ventaja de usar anticuerpos monoclonales es la mayor probabilidad de reproducir resultados experimentales, como consecuencia de una menor variación entre las diferentes producciones de lotes. Esta mayor monoespecificidad también proporciona una menor reactividad cruzada con otros antígenos, lo que resulta en una menor tinción de fondo. Sin embargo, la consecuencia natural de esta monoespecificidad es una señal menos robusta en comparación con los anticuerpos policlonales.

Los anticuerpos policlonales resultan de múltiples clones de células B que surgen contra un antígeno específico inoculado en un animal huésped. Estos animales hospedadores suelen ser más variados que en la producción de anticuerpos monoclonales e incluyen especies como el caballo, el burro, el cerdo, el ratón y el conejo. Debido a que los antisueros policlonales incluyen múltiples anticuerpos de diversos clones de células B, existe un mayor potencial para reconocer diferentes configuraciones de epítopos. Posteriormente, esto también significa que se debe esperar una mayor variación entre diferentes producciones de lotes. Una ventaja inherente del uso de anticuerpos policlonales es una mayor detección de señal debido a las múltiples configuraciones de epítopos que pueden reconocerse. También hay una mayor tolerancia a los cambios en las condiciones experimentales que podrían inducir cambios en la estructura del epítopo. Sin embargo, un mayor reconocimiento de epítopos también puede dar como resultado una tinción más inespecífica que produce una señal de fondo más alta. Los anticuerpos policlonales pueden mostrar menores posibilidades de reproducir resultados experimentales como consecuencia de una mayor variación de lote a lote.

¿Debo preocuparme por la especie hospedadora del anticuerpo primario?

En general, se debe tener precaución al usar un anticuerpo que se haya producido en el mismo hospedador donde se va a realizar el estudio. La tinción con anticuerpos secundarios generalmente se dirige contra la especie donde se produjo el anticuerpo primario. Si las muestras incluyen la misma especie animal, tanto en el anticuerpo primario como en el tejido en estudio, se puede esperar que los anticuerpos secundarios tiñan indiscriminadamente todas las estructuras en las muestras lo que causaría un error en la interpretación de los resultados.

Noviembre 2018, Biólogo Carlos Torrealba.

  Carlos Torrealba