December 14, 2016

 

Las enzimas de restricción son enzimas que reconocen y cortan las moléculas de DNA por secuencias nucleotídicas específicas (Klug y col., 2006).  Aunque estas enzimas desempeñan una función propia en las células procariotas en las que se descubrieron, son particularmente importantes por su empleo experimental en varias áreas de la biología molecular, de interés tanto básico como aplicado al diagnóstico clínico; en especial, se utilizan en el proceso de clonación molecular del DNA. Además, tienen aplicación en otras técnicas como la secuenciación del genoma y el estudio de los polimorfismos (Luque y Herráez, 2002).

En 1971, un artículo publicado por Kathleen Danna y Daniel Nathans marcó el inicio de la era del DNA recombinante. Este artículo describe el aislamiento de una enzima de una cepa bacteriana y la utilización de esta enzima para cortar DNA vírico por secuencias nucleotídicas específicas. Contiene la primera fotografía publicada de DNA cortado con una de estas proteínas. Utilizando enzimas de restricción y otros recursos diversos, entre mediados y finales de la década de 1970 se desarrollaron técnicas para generar, replicar y analizar moléculas de DNA recombinante. Este conjunto de métodos, denominados tecnología del DNA recombinante, supusieron un progreso importante en la investigación y permitieron a cientos de científicos aislar y estudiar secuencias específicas de DNA. Por sus contribuciones al desarrollo de esta tecnología, en 1978 Nathans, Hamilton Smith y Werner Arber fueron galardonados con el premio Nobel de fisiología y medicina (Klug y col., 2006). 

Figura 1. Dan Nathans (izq.) y Hamilton Smith (der.) en el laboratorio en la universidad Johns Hopkins. Tomado de Roberts (2005).

Las enzimas de restricción son producidas por las bacterias como un mecanismo de defensa contra las infecciones víricas, concretamente contra virus bacteriófagos, cuya reproducción depende de la maquinaria genética de la bacteria. Se trata de los sistemas de restricción-modificación o metilación-restricción. Para cada enzima de restricción, una metilasa reconoce la misma secuencia que constituye el sitio de restricción y une covalentemente grupos metilo a determinadas bases del DNA en dicha secuencia. El mecanismo de defensa es el siguiente: el DNA propio de la bacteria es metilado de una forma específica, característica de cada especie bacteriana (en las secuencias reconocidas tanto por la restrictasa como por la metilasa de esa especie). La metilación de las bases impide la unión de la enzima de restricción, con lo que el DNA propio no es hidrolizado. Por el contrario, al entrar en la célula DNA de otro organismo, no metilado o con un patrón de metilación diferente, este DNA puede ser degradado por la enzima de restricción, ya que carece de los grupos metilo en la secuencia diana (por razones puramente aleatorias, en cualquier genoma habrá un cierto número de secuencias e 6, 6 u 8 pares de bases iguales a la reconocida por la enzima, por lo tanto, habrá secuencias diana disponibles). A partir de este mecanismo de acción combinada surgió precisamente el nombre de enzimas de restricción, ya que la acción de estas enzimas restringe la posibilidad de infección por virus (Luque y Herráez, 2002).

Las enzimas de restricción se nombran con tres letras tomadas del género y especie de la bacteria de la que se aislaron originalmente, seguidas a veces por una letra más, que identifica el serotipo (variante antigénica de la bacteria) y finalmente por un número romano que las  identifica en caso de que en una misma variante se hayan encontrado varias enzimas con distinta especificidad:

                                                                                    

Estas enzimas se han clasificado en tres grupos distintos (tipo I, tipo II y tipo III) de acuerdo a sus propiedades, siendo las de tipo II las más estudiadas debido a su utilidad en el campo de la bilogía molecular, sobretodo en el área de genética molecular. Las secuencias de reconocimiento de las enzimas de restricción tipo tienen una simetría palindrómica, es decir, dichas secuencias se leen igual en ambas cadenas del DNA en dirección 5’ – 3’.

Figura 2. Algunas enzimas de restricción tipo II comunes, con sus secuencias de reconocimiento, los patrones de corte y su origen. Adaptado de Klug y col. (2006).

Una de las primeras enzimas de restricción identificadas fue aislada de la cepa R de Escherichia coli y se denominó Eco RI. Los fragmentos de DNA producidos por digestión con Eco RI tienen colas protuberantes de cadena sencilla (“extremos cohesivos”) que pueden formar puentes de hidrógeno con colas complementarias de cadena sencilla que fragmentos de DNA que provengan de cualquier otra fuente. Si se mezclan en las condiciones adecuadas, los fragmentos de DNA de dos fuentes diferentes forman moléculas recombinantes por la unión mediante puentes de hidrógeno de sus extremos cohesivos (Klug y col., 2006).  Los enlaces covalentes faltantes entre los extremos cohesivos de fragmentos reasociados se pueden “sellar” por la acción de las enzimas DNA ligasas, dando lugar a una molécula de DNA recombinante. En el siguiente video se ilustra brevemente este proceso.

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Biol. Iván León, Allscience.

 

Referencia bibliográficas:
Klug, W.S; Cummings, M.R; Spencer, C.A. 2006. Conceptos de Genética. Octava edición. Pearson Educación. Madrid, España.


Luque, J; Herráez, A. 2002. Texto Ilustrado de Biología Molecular e Ingeniería Genética, conceptos, técnicas y aplicaciones en ciencias de la salud. Primera edición. Elsevier Science. Madrid, España.


Roberts, R.J. 2005. How restriction enzymes became the workhorses of molecular biology. Proc. Natl. Acad. Sci. 102: 5905–5908.